Kromatografi

A.Pendahuluan

1.1 Latar belakang

Di dalam bidang pengolahan hasil peternakan terutama yang menyangkut masalah teknologi hasil ternak untuk meningkatkan kualitas produksi tidak bisa lepas dari penelitian dan pengujian yang sudah pasti pengujian tersebut menggunakan alat-alat yang berteknologi canggih. Mulai dari proses pengujian awal sampai tahap produksi semua membutuhkan alat. Banyak sekali teknologi canggih yang telah dipakai dalam bidang peternakan terutama pada bagian pengolahanya,mulai dari yang sederhana sampai yang rumit.

Berawal dari kemajuan IPTEK tersebut maka sangat diharapkan terutama bagi orang-orang yang berkecimpung di bidang peternakan khususnya kita sebagai calon sarjana peternakan harus benar-benar menguasai semua jenis teknologi yang berhubungan dengan bidang peternakan demi mengembangkan potensi dan sumber daya peternakan Indonesia.

Kita tahu bahwa sebenarnya Indonesia memiliki potensi yang sangat besar untuk dikembangkanya peternakan, karena masih banyak lahan-lahan kosong yang masih belum dimanfaatkan secara maksimal terutama daerah di luar Jawa. Di tambah lagi kebutuhan akan produk peternakan terutama daging dan susu yang masih belum bisa menyediakan secara maksimal untuk negeri dan sampai sekarang bangsa Indonesia masih mengandalkan imppor dari negera lain dengan harga yang relatif mahal. Selain itu,seandainya bisa memproduksi sendiri kualitasnya pun masih sangat rendah dan belum mampu bersaing dengan nagara lain.

Itu semua merupakan tanggung jawab kita semua terutama orang peternakan untuk terus mengembangkan dan menciptaknan inovasi baru dalam meningkatkan potensi,kualitas produksi,dan sumber daya manusianya agar dunia peternakan Indoesia dapat berkembang pesat dengan berstandar IPTEK.,mampu memenuhi kebutuhan produksi ternak dalam negeri,dapat menekan harga jual sehingga semua lapisan  masyarakat mampu menikmati hasil peternakan dalam negeri.

Dalam pembahasan kali ini mengenai perkembangan IPTEK dalam bidang peternakan kita akan membahas tentang alat-alat yang digunakan dalam pegolahan hasil peternaknan.Karena sangat banyak sekali alat yang digunakan,maka kami lebih memfokuskan pada sebuah alat yaitu KROMATOGRAFI.Dalam laporan praktikum ini akan dibahas secara detail mengenai apa dan bagaimana serta seperti apa prinsip kerjanya,dan masih banyak lagi hal-hal yang akan dibahas.

1.2 Tujuan praktikum

1.Memenuhi syarat kelulusan mata kuliah Peralatan dan Teknik Analisis Laboratorium.

2.Mengenal dan mengetahui prinsip kerja,prosedur kerja,analisis senyawa.

3.Membuat rancangan laporan akhir kromatografi.

1.3 Manfaat praktikum

1.Mampu menggunakan kromatografi sesuai prosedur yang benar.

2.Mampu menganalisis suatu senyawa dengan benar.

3.Mampu melakukan analisis secara kromatografi kertas.

4.Memahami prinsip pemisahan dan alat-alat yang digunakan.

B. Tinjauan Pustaka

Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan molekul berdasarkan perbedaan pola pergerakan antara fase gerak dan fase diam untuk memisahkan komponen (berupa molekul) yang berada pada larutan.Molekul yang terlarut dalam fase gerak, akan melewati kolom yang merupakan fase diam.Molekul yang memiliki ikatan yang kuat dengan kolom akan cenderung bergerak lebih lambat dibanding molekul yang berikatan lemah.Dengan ini, berbagai macam tipe molekul dapat dipisahkan berdasarkan pergerakan pada kolom.Setelah komponen terelusi dari kolom, komponen tersebut dapat dianalisa dengan menggunakan detektor atau dapat dikumpulkan untuk analisa lebih lanjut.Beberapa alat-alat analitik dapat digabungkan dengan metode pemisahan untuk analisis secara on-line (on-line analysis) seperti: penggabungan kromatografi gas (gas chromatography) dan kromatografi cair (liquid chromatography) dengan mass spectrometry (GC-MS dan LC-MS), Fourier-transform infrared spectroscopy (GC-FTIR), dan diode-array UV-VIS (HPLC-UV-VIS). (Tissue BM. 2000)

Jenis Kromatografi diantaranya adalah Kromatografi Cair (LiquidChromatography)Kromatografi cair merupakan teknik yang tepat untuk memisahkan ion atau molekul yang terlarut dalam suatu larutan. Jika larutan sampel berinteraksi dengan fase stasioner, maka molekul-molekul didalamnya berinteraksi dengan fase stasioner; namun interaksinya berbeda dikarenakan perbedaan daya serap (adsorption), pertukaran ion (ion exchange), partisi (partitioning), atau ukuran. Perbedaan ini membuat komponen terpisah satu dengan yang lain dan dapat dilihat perbedaannya dari lamanya waktu transit komponen tersebut melewati kolom.Terdapat beberapa jenis kromatografi cair, diantaranya: reverse phase chromatography, High Performance Liquid Chromatography (HPLC), size exclusion chromatography, serta supercritical fluid chromatography. Reverse phase chromatographyReverse phase chromatography merupakan alat analitikal yang kuat dengan memadukan sifat hidrofobik serta rendahnya polaritas fase stasioner yang terikat secara kimia pada padatan inert seperti silika.Metode ini biasa digunakan untuk proses ekstraksi dan pemisahan senyawa yang tidak mudah menguap (non-volatile).(Bordanaro J, Yip K. 2001)

High performance liquid chromatographyHigh performance liquid chromatography (HPLC) mempunyai prinsip yang mirip dengan reverse phase.Hanya saja dalam metode ini, digunakan tekanan dan kecepatan yang tinggi.Kolom yang digunakan dalam HPLC lebih pendek dan berdiameter kecil, namun dapat menghasilkan beberapa tingkatan equilibrium dalam jumlah besar.Size exclusion chromatographySize exclusion chromatography, atau yang dikenal juga dengan gel permeation atau filtration chromatography biasa digunakan untuk memisahkan dan memurnikan protein.Metode ini tidak melibatkan berbagai macam penyerapan dan sangat cepat.Perangkat kromatografi berupa gel berpori yang dapat memisahkan molekul besar dan molekul kecil.Molekul besar akan terelusi terlebih dahulu karena molekul tersebut tidak dapat penetrasi pada pori-pori.(Yuningsih.2008)

Kromatografi Pertukaran Ion (Ion-Exchange Chromatography)Kromatografi pertukaran ion (ion-exchange chromatography) biasa digukanan untuk pemurnian materi biologis, seperti asam amino, peptida, protein.Metode ini dapat dilakukan dalam dua tipe, yaitu dalam kolom maupun ruang datar (planar).Terdapat dua tipe pertukaran ion, yaitu pertukaran kation (cation exchange) dan pertukaran anion (anion exchange).Pada pertukaran kation, fase stasioner bermuatan negatif; sedangkan pada pertukaran anion, fase stasioner bermuatan positif.Molekul bermuatan yang berada pada fase cair akan melewati kolom.Jika muatan pada molekul sama dengan kolom, maka molekul tersebut akan terelusi.Namun jika muatan pada molekul tidak sama dengan kolom, maka molekul tersebut akan membentuk ikatan ionik dengan kolom.Untuk mengelusi molekul yang menempel pada kolom diperlukan penambahan larutan dengan pH dan kekuatan ionik tertentu.Pemisahan dengan metode ini sangat selektif dan karena biaya untuk menjalankan metode ini murah serta kapasitasnya tinggi, maka metode ini biasa digunakan pada awal proses keseluruhan.( Bordanaro J, Yip K.2010)

Kromatografi partisi

Prinsip kromatografi partisi dapat dijelaskan dengan hukum partisi yang dapat diterapkan pada sistem multikomponen yang dibahas di bagian sebelumnya. Dalam kromatografi partisi, ekstraksi terjadi berulang dalam satu kali proses. Dalam percobaan, zat terlarut didistribusikan antara fasa stationer dan fasa mobil. Fasa stationer dalam banyak kasus pelarut diadsorbsi pada adsorben dan fasa mobil adalah molekul pelarut yang mengisi ruang antar partikel yang ter adsorbsi.Contoh khas kromatografi partisi adalah kromatografi kolom yang digunakan luas karena merupakan sangat efisien untuk pemisahan senyawa organic.Kolomnya (tabung gela) diisi dengan bahan seperti alumina, silika gel atau pati yang dicampur dengan adsorben, dan pastanya diisikan kedalam kolom. Larutan sampel kemudian diisikan kedalam kolom dari atas sehingga sammpel diasorbsi oleh adsorben. Kemudian pelarut (fasa mobil; pembawa) ditambahkan tetes demi tetes dari atas kolom.Partisi zat terlarut berlangsung di pelarut yang turun ke bawah (fasa mobil) dan pelarut yang teradsorbsi oleh adsorben (fasa stationer). Selama perjalanan turun, zat terlarut akan mengalami proses adsorpsi dan partisi berulang-ulang. Laju penurunan berbeda untuk masing-masing zat terlarut dan bergantung pada koefisien partisi masing-masing zat terlarut. Akhirnya, zat terlarut akan terpisahkan membentuk beberapa lapisan.Akhirnya, masing-masing lapisan dielusi dengan pelarut yang cocok untuk memberikan spesimen murninya. Nilai R didefinisikan untuk tiap zat etralrut dengan persamaan berikut.

R = (jarak yang ditempuh zat terlarut) / (jarak yang ditempuh pelarut/fasa mobil).

( McKay P. 2010)

Kromatografi kertas

Mekanisme pemisahan dengan kromatografi kertas prinsipnya sama dengan mekanisme pada kromatografi kolom. Adsorben dalam kromatografi kertas adalah kertas saring, yakni selulosa. Sampel yang akan dianalisis ditotolkan ke ujung kertas yang kemudian digantung dalam wadah. Kemudian dasar kertas saring dicelupkan kedalam pelarut yang mengisi dasar wadah. Fasa mobil (pelarut) dapat saja beragam. Air, etanol, asam asetat atau campuran zat-zat ini dapat digunakan.Kromatografi kertas diterapkan untuk analisis campuran asam amino dengan sukses besar. Karena asam amino memiliki sifat yang sangat mirip, dan asam-asam amino larut dalam air dan tidak mudah menguap (tidak mungkin didistilasi), pemisahan asam amino adalah masalah paling sukar yang dihadapi kimiawan di akhir abad 19 dan awal abad 20. Jadi penemuan kromatografi kertas merupakan berita sangat baik bagi mereka.Kimiawan Inggris Richard Laurence Millington Synge (1914-1994) adalah orang pertama yang menggunakan metoda analisis asam amino dengan kromatografi kertas. Saat campuran asam amino menaiki lembaran kertas secara vertikal karena ada fenomena kapiler, partisi asam amino antara fasa mobil dan fasa diam (air) yang teradsorbsi pada selulosa berlangsung berulang-ulang. Ketiak pelarut mencapai ujung atas kertas proses dihentikan. Setiap asam amino bergerak dari titik awal sepanjang jarak tertentu. Dari nilai R, masing-masing asam amino diidentifikasi.Kromatografi kertas dua-dimensi (2D) menggunakan kertas yang luas bukan lembaran kecil, dan sampelnya diproses secara dua dimensi dengan dua pelarut. (Hargreaves S. 2010)

Kromatografi gas

Campuran gas dapat dipisahkan dengan kromatografi gas. Fasa stationer dapat berupa padatan (kromatografi gas-padat) atau cairan (kromatografi gas-cair).Umumnya, untuk kromatografi gas-padat, sejumlah kecil padatan inert misalnya karbon teraktivasi, alumina teraktivasi, silika gel atau saringan molekular diisikan ke dalam tabung logam gulung yang panjang (2-10 m) dan tipis. Fasa mobil adalah gas semacam hidrogen, nitrogen atau argon dan disebut gas pembawa. Pemisahan gas bertitik didih rendah seperti oksigen, karbon monoksida dan karbon dioksida dimungkinkan dengan teknik ini.Dalam kasus kromatografi gas-cair, ester seperti ftalil dodesilsulfat yang diadsorbsi di permukaan alumina teraktivasi, silika gel atau penyaring molekular, digunakan sebagai fasa diam dan diisikan ke dalam kolom. Campuran senyawa yang mudah menguap dicampur dengan gas pembawa disuntikkan ke dalam kolom, dan setiap senyawa akan dipartisi antara fasa gas (mobil) dan fasa cair (diam) mengikuti hukum partisi. Senyawa yang kurang larut dalam fasa diam akan keluar lebih dahulu.Metoda ini khususnya sangat baik untuk analisis senyawa organik yang mudah menguap seperti hidrokarbon dan ester. Analisis minyak mentah dan minyak atsiri dalam buah telah dengan sukses dilakukan dengan teknik ini.Efisiensi pemisahan ditentukan dengan besarnya interaksi antara sampel dan cairannya. Disarankan untuk mencoba fasa cair standar yang diketahui efektif untuk berbagai senyawa. Berdasarkan hasil ini, cairan yang lebih khusus kemudian dapat dipilih. Metoda deteksinya, akan mempengaruhi kesensitifan teknik ini. Metoda yang dipilih akan bergantung apakah tujuannya analisik atau preparatif. (James.2003)

C. Metode Praktikum

1.1  Alat

1.Bejana/toples yang ditutup aluminium foil 1 buah

2.Kertas Whatman/menggunakan kertas saring Whatman

3.Tempat pelarut

4.Batang lidi ukuran 15 cm sebagai penggantung kertas

5.Blower untuk pengeringan kertas

6.Sinar UV untuk melihat warna sampel yang kurang jelas

1.2  Bahan :                              Pelarut :

1.Safranin                                      Heksan:metanol:ethil asetat =1:1:1

2.Sirup

3.Methylen blue

4.Minyak

1.3 Prosedur kerja

1.Potong kertas Whatman sesuai kebutuhan dan ukuran bejana yang ada

2.Garis tipis dengan pensil dengan jarak 2 cm dari sisi bawah kertas

3.Beri tanda titik tempat sampel akan diletakkan dengan jarak 1,5-2 cm jarak tiap sampel

4.Letakkan sampel pada tiap titik sebanyak 10 ul memakai pipet kapiler

5.Sampel dikeringkan dengan blower

6.Masukkan pelarut dengan ketinggian 1-1,5 cm ke dalam bejana

7.Masukkan kertas Whatman yang telah ditetesi sampel

8.Lakukan pengembangan selama 10-15 menit/sampai pelarut hampir mencapai  batas ke-tinggian 2 cm dari batas atas/dengan ketinggia secukupnya sesuai keperluan,jika pelarut sampai  tengah kertas saring telah menunjukkan pemisahan sudah bisa dihentikan

9.Berilah tanda batas pelarut bagian atas

10.Tentukan nilai Rf dengan rumus (Rf)

11.Lakukan pengamatan,tulis hasil dan pembahasan terhadap senyawa dan komponen pada Kromatogram

D.Hasil dan pembahasan

Kromatografi adalah alat/metode untuk memisahkan senyawa berdasarkan 2 fase yaitu fase diam dan fase gerak.Fase diam adalah kertas Whatman dan fase geraknya adalah pelarut.Dalam kromatografi ada 2 prinsip dasar yaitu absorbsi dan partisi.Absorbsi adalah penyerapan dan pengikatan zat warna,sedangkan partisi adalah pemisahan zat warna.Ada 2 fase dalam penggunaan kromatografi yaitu fase gerak dan fase cair.Hal ini jika dibandingkan dengan dengan literatur adalah sama.Dalam literatur tertulis :

“ Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan molekul berdasarkan perbedaan pola pergerakan antara fase gerak dan fase diam untuk memisahkan komponen (berupa molekul) yang berada pada larutan.Molekul yang terlarut dalam fase gerak, akan melewati kolom yang merupakan fase diam.Molekul yang memiliki ikatan yang kuat dengan kolom akan cenderung bergerak lebih lambat dibanding molekul yang berikatan lemah.Dengan ini, berbagai macam tipe molekul dapat dipisahkan berdasarkan pergerakan pada kolom.Setelah komponen terelusi dari kolom, komponen tersebut dapat dianalisa dengan menggunakan detektor atau dapat dikumpulkan untuk analisa lebih lanjut.Beberapa alat-alat analitik dapat digabungkan dengan metode pemisahan untuk analisis secara on-line (on-line analysis) seperti: penggabungan kromatografi gas (gas chromatography) dan kromatografi cair (liquid chromatography) dengan mass spectrometry (GC-MS dan LC-MS), Fourier-transform infrared spectroscopy (GC-FTIR), dan diode-array UV-VIS (HPLC-UV-VIS). (Tissue BM. 2000)  “

Dalam pembuatan pelarut digunakan 3 macam bahan yaitu heksan,metanol,dan ethil asetat dengan perbandingan masing-masing 1:1:1.Heksan bersifat non polar,metanol bersifat polar,dan ethil asetat bersifat semi polar.Bahan yang digunakan adalah minyak,safranin,methylen blue,dan sirup.

Semakin jauh jarak yang ditempuh komponen/sampel maka sifat sampel tersebut semakin non polar sedangkan yang menempuh jarak terpendek maka sampel tersebut semakin bersifat polar.Dengan kata lain semakkin besar nilai Rf maka semakin non polar.Alat dan bahan yang digunakan adalah :

Alat : 1.Bejana/toples yang ditutup aluminium foil 1 buah

2.Kertas Whatman/menggunakan kertas saring Whatman

3.Tempat pelarut

4.Batang lidi ukuran 15 cm sebagai penggantung kertas

5.Blower untuk pengeringan kertas

6.Sinar UV untuk melihat warna sampel yang kurang jelas

Bahan :

1.Safranin

2.Sirup

3.Methylen blue

4.Minyak

Pelarut :

Heksan:metanol:ethil asetat =1:1:1

Prosedur kerja :

1.Potong kertas Whatman sesuai kebutuhan dan ukuran bejana yang ada

2.Garis tipis dengan pensil dengan jarak 2 cm dari sisi bawah kertas

3.Beri tanda titik tempat sampel akan diletakkan dengan jarak 1,5-2 cm jarak tiap sampel

4.Letakkan sampel pada tiap titik sebanyak 10 ul memakai pipet kapiler

5.Sampel dikeringkan dengan blower

6.Masukkan pelarut dengan ketinggian 1-1,5 cm ke dalam bejana

7.Masukkan kertas Whatman yang telah ditetesi sampel

8.Lakukan pengembangan selama 10-15 menit/sampai pelarut hampir mencapai  batas ketinggian 2 cm dari batas atas/dengan ketinggia secukupnya sesuai keperluan,jika pelarut sampai  tengah kertas saring telah menunjukkan pemisahan sudah bisa dihentikan

9.Berilah tanda batas pelarut bagian atas

10.Tentukan nilai Rf dengan rumus (Rf)

11.Lakukan pengamatan,tulis hasil dan pembahasan terhadap senyawa dan komponen pada Kromatogram

E. Kesimpulan dan saran

1.Kromatografi adalah alat/metode untuk memisahkan sampel berdasarkan 2 fase,yaitu fase gerak (pelarut) dan fase diam (kertas whatman)

2.Kromatografi ada 2 prinsip yaitu absorbsi (penyerapan dan pengikatan zat warna) dan partisi (pengikatan zat warna)

3.Semakin tinggi nilai Rf maka semakin non polar sampel yang diuji dan sebaliknya,semakin rendah nilai Rf maka semakin polar sampel yang diuji Dalam melakukan analisis pemisahan suatu senyawa dengan menggunakan kromatografi sebaiknya dilakukan dengan sangat teliti terutama dalam mengukur tinggi/jarak yang ditempuh sampel maupun pelarutnya,jika panjang warnanya kurang jelas bisa dilihat menggunakan sinar UV agar hasilnya lebih akurat.