Kromatografi

A.Pendahuluan

1.1 Latar belakang

Di dalam bidang pengolahan hasil peternakan terutama yang menyangkut masalah teknologi hasil ternak untuk meningkatkan kualitas produksi tidak bisa lepas dari penelitian dan pengujian yang sudah pasti pengujian tersebut menggunakan alat-alat yang berteknologi canggih. Mulai dari proses pengujian awal sampai tahap produksi semua membutuhkan alat. Banyak sekali teknologi canggih yang telah dipakai dalam bidang peternakan terutama pada bagian pengolahanya,mulai dari yang sederhana sampai yang rumit.

Berawal dari kemajuan IPTEK tersebut maka sangat diharapkan terutama bagi orang-orang yang berkecimpung di bidang peternakan khususnya kita sebagai calon sarjana peternakan harus benar-benar menguasai semua jenis teknologi yang berhubungan dengan bidang peternakan demi mengembangkan potensi dan sumber daya peternakan Indonesia.

Kita tahu bahwa sebenarnya Indonesia memiliki potensi yang sangat besar untuk dikembangkanya peternakan, karena masih banyak lahan-lahan kosong yang masih belum dimanfaatkan secara maksimal terutama daerah di luar Jawa. Di tambah lagi kebutuhan akan produk peternakan terutama daging dan susu yang masih belum bisa menyediakan secara maksimal untuk negeri dan sampai sekarang bangsa Indonesia masih mengandalkan imppor dari negera lain dengan harga yang relatif mahal. Selain itu,seandainya bisa memproduksi sendiri kualitasnya pun masih sangat rendah dan belum mampu bersaing dengan nagara lain.

Itu semua merupakan tanggung jawab kita semua terutama orang peternakan untuk terus mengembangkan dan menciptaknan inovasi baru dalam meningkatkan potensi,kualitas produksi,dan sumber daya manusianya agar dunia peternakan Indoesia dapat berkembang pesat dengan berstandar IPTEK.,mampu memenuhi kebutuhan produksi ternak dalam negeri,dapat menekan harga jual sehingga semua lapisan  masyarakat mampu menikmati hasil peternakan dalam negeri.

Dalam pembahasan kali ini mengenai perkembangan IPTEK dalam bidang peternakan kita akan membahas tentang alat-alat yang digunakan dalam pegolahan hasil peternaknan.Karena sangat banyak sekali alat yang digunakan,maka kami lebih memfokuskan pada sebuah alat yaitu KROMATOGRAFI.Dalam laporan praktikum ini akan dibahas secara detail mengenai apa dan bagaimana serta seperti apa prinsip kerjanya,dan masih banyak lagi hal-hal yang akan dibahas.

1.2 Tujuan praktikum

1.Memenuhi syarat kelulusan mata kuliah Peralatan dan Teknik Analisis Laboratorium.

2.Mengenal dan mengetahui prinsip kerja,prosedur kerja,analisis senyawa.

3.Membuat rancangan laporan akhir kromatografi.

1.3 Manfaat praktikum

1.Mampu menggunakan kromatografi sesuai prosedur yang benar.

2.Mampu menganalisis suatu senyawa dengan benar.

3.Mampu melakukan analisis secara kromatografi kertas.

4.Memahami prinsip pemisahan dan alat-alat yang digunakan.

B. Tinjauan Pustaka

Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan molekul berdasarkan perbedaan pola pergerakan antara fase gerak dan fase diam untuk memisahkan komponen (berupa molekul) yang berada pada larutan.Molekul yang terlarut dalam fase gerak, akan melewati kolom yang merupakan fase diam.Molekul yang memiliki ikatan yang kuat dengan kolom akan cenderung bergerak lebih lambat dibanding molekul yang berikatan lemah.Dengan ini, berbagai macam tipe molekul dapat dipisahkan berdasarkan pergerakan pada kolom.Setelah komponen terelusi dari kolom, komponen tersebut dapat dianalisa dengan menggunakan detektor atau dapat dikumpulkan untuk analisa lebih lanjut.Beberapa alat-alat analitik dapat digabungkan dengan metode pemisahan untuk analisis secara on-line (on-line analysis) seperti: penggabungan kromatografi gas (gas chromatography) dan kromatografi cair (liquid chromatography) dengan mass spectrometry (GC-MS dan LC-MS), Fourier-transform infrared spectroscopy (GC-FTIR), dan diode-array UV-VIS (HPLC-UV-VIS). (Tissue BM. 2000)

Jenis Kromatografi diantaranya adalah Kromatografi Cair (LiquidChromatography)Kromatografi cair merupakan teknik yang tepat untuk memisahkan ion atau molekul yang terlarut dalam suatu larutan. Jika larutan sampel berinteraksi dengan fase stasioner, maka molekul-molekul didalamnya berinteraksi dengan fase stasioner; namun interaksinya berbeda dikarenakan perbedaan daya serap (adsorption), pertukaran ion (ion exchange), partisi (partitioning), atau ukuran. Perbedaan ini membuat komponen terpisah satu dengan yang lain dan dapat dilihat perbedaannya dari lamanya waktu transit komponen tersebut melewati kolom.Terdapat beberapa jenis kromatografi cair, diantaranya: reverse phase chromatography, High Performance Liquid Chromatography (HPLC), size exclusion chromatography, serta supercritical fluid chromatography. Reverse phase chromatographyReverse phase chromatography merupakan alat analitikal yang kuat dengan memadukan sifat hidrofobik serta rendahnya polaritas fase stasioner yang terikat secara kimia pada padatan inert seperti silika.Metode ini biasa digunakan untuk proses ekstraksi dan pemisahan senyawa yang tidak mudah menguap (non-volatile).(Bordanaro J, Yip K. 2001)

High performance liquid chromatographyHigh performance liquid chromatography (HPLC) mempunyai prinsip yang mirip dengan reverse phase.Hanya saja dalam metode ini, digunakan tekanan dan kecepatan yang tinggi.Kolom yang digunakan dalam HPLC lebih pendek dan berdiameter kecil, namun dapat menghasilkan beberapa tingkatan equilibrium dalam jumlah besar.Size exclusion chromatographySize exclusion chromatography, atau yang dikenal juga dengan gel permeation atau filtration chromatography biasa digunakan untuk memisahkan dan memurnikan protein.Metode ini tidak melibatkan berbagai macam penyerapan dan sangat cepat.Perangkat kromatografi berupa gel berpori yang dapat memisahkan molekul besar dan molekul kecil.Molekul besar akan terelusi terlebih dahulu karena molekul tersebut tidak dapat penetrasi pada pori-pori.(Yuningsih.2008)

Kromatografi Pertukaran Ion (Ion-Exchange Chromatography)Kromatografi pertukaran ion (ion-exchange chromatography) biasa digukanan untuk pemurnian materi biologis, seperti asam amino, peptida, protein.Metode ini dapat dilakukan dalam dua tipe, yaitu dalam kolom maupun ruang datar (planar).Terdapat dua tipe pertukaran ion, yaitu pertukaran kation (cation exchange) dan pertukaran anion (anion exchange).Pada pertukaran kation, fase stasioner bermuatan negatif; sedangkan pada pertukaran anion, fase stasioner bermuatan positif.Molekul bermuatan yang berada pada fase cair akan melewati kolom.Jika muatan pada molekul sama dengan kolom, maka molekul tersebut akan terelusi.Namun jika muatan pada molekul tidak sama dengan kolom, maka molekul tersebut akan membentuk ikatan ionik dengan kolom.Untuk mengelusi molekul yang menempel pada kolom diperlukan penambahan larutan dengan pH dan kekuatan ionik tertentu.Pemisahan dengan metode ini sangat selektif dan karena biaya untuk menjalankan metode ini murah serta kapasitasnya tinggi, maka metode ini biasa digunakan pada awal proses keseluruhan.( Bordanaro J, Yip K.2010)

Kromatografi partisi

Prinsip kromatografi partisi dapat dijelaskan dengan hukum partisi yang dapat diterapkan pada sistem multikomponen yang dibahas di bagian sebelumnya. Dalam kromatografi partisi, ekstraksi terjadi berulang dalam satu kali proses. Dalam percobaan, zat terlarut didistribusikan antara fasa stationer dan fasa mobil. Fasa stationer dalam banyak kasus pelarut diadsorbsi pada adsorben dan fasa mobil adalah molekul pelarut yang mengisi ruang antar partikel yang ter adsorbsi.Contoh khas kromatografi partisi adalah kromatografi kolom yang digunakan luas karena merupakan sangat efisien untuk pemisahan senyawa organic.Kolomnya (tabung gela) diisi dengan bahan seperti alumina, silika gel atau pati yang dicampur dengan adsorben, dan pastanya diisikan kedalam kolom. Larutan sampel kemudian diisikan kedalam kolom dari atas sehingga sammpel diasorbsi oleh adsorben. Kemudian pelarut (fasa mobil; pembawa) ditambahkan tetes demi tetes dari atas kolom.Partisi zat terlarut berlangsung di pelarut yang turun ke bawah (fasa mobil) dan pelarut yang teradsorbsi oleh adsorben (fasa stationer). Selama perjalanan turun, zat terlarut akan mengalami proses adsorpsi dan partisi berulang-ulang. Laju penurunan berbeda untuk masing-masing zat terlarut dan bergantung pada koefisien partisi masing-masing zat terlarut. Akhirnya, zat terlarut akan terpisahkan membentuk beberapa lapisan.Akhirnya, masing-masing lapisan dielusi dengan pelarut yang cocok untuk memberikan spesimen murninya. Nilai R didefinisikan untuk tiap zat etralrut dengan persamaan berikut.

R = (jarak yang ditempuh zat terlarut) / (jarak yang ditempuh pelarut/fasa mobil).

( McKay P. 2010)

Kromatografi kertas

Mekanisme pemisahan dengan kromatografi kertas prinsipnya sama dengan mekanisme pada kromatografi kolom. Adsorben dalam kromatografi kertas adalah kertas saring, yakni selulosa. Sampel yang akan dianalisis ditotolkan ke ujung kertas yang kemudian digantung dalam wadah. Kemudian dasar kertas saring dicelupkan kedalam pelarut yang mengisi dasar wadah. Fasa mobil (pelarut) dapat saja beragam. Air, etanol, asam asetat atau campuran zat-zat ini dapat digunakan.Kromatografi kertas diterapkan untuk analisis campuran asam amino dengan sukses besar. Karena asam amino memiliki sifat yang sangat mirip, dan asam-asam amino larut dalam air dan tidak mudah menguap (tidak mungkin didistilasi), pemisahan asam amino adalah masalah paling sukar yang dihadapi kimiawan di akhir abad 19 dan awal abad 20. Jadi penemuan kromatografi kertas merupakan berita sangat baik bagi mereka.Kimiawan Inggris Richard Laurence Millington Synge (1914-1994) adalah orang pertama yang menggunakan metoda analisis asam amino dengan kromatografi kertas. Saat campuran asam amino menaiki lembaran kertas secara vertikal karena ada fenomena kapiler, partisi asam amino antara fasa mobil dan fasa diam (air) yang teradsorbsi pada selulosa berlangsung berulang-ulang. Ketiak pelarut mencapai ujung atas kertas proses dihentikan. Setiap asam amino bergerak dari titik awal sepanjang jarak tertentu. Dari nilai R, masing-masing asam amino diidentifikasi.Kromatografi kertas dua-dimensi (2D) menggunakan kertas yang luas bukan lembaran kecil, dan sampelnya diproses secara dua dimensi dengan dua pelarut. (Hargreaves S. 2010)

Kromatografi gas

Campuran gas dapat dipisahkan dengan kromatografi gas. Fasa stationer dapat berupa padatan (kromatografi gas-padat) atau cairan (kromatografi gas-cair).Umumnya, untuk kromatografi gas-padat, sejumlah kecil padatan inert misalnya karbon teraktivasi, alumina teraktivasi, silika gel atau saringan molekular diisikan ke dalam tabung logam gulung yang panjang (2-10 m) dan tipis. Fasa mobil adalah gas semacam hidrogen, nitrogen atau argon dan disebut gas pembawa. Pemisahan gas bertitik didih rendah seperti oksigen, karbon monoksida dan karbon dioksida dimungkinkan dengan teknik ini.Dalam kasus kromatografi gas-cair, ester seperti ftalil dodesilsulfat yang diadsorbsi di permukaan alumina teraktivasi, silika gel atau penyaring molekular, digunakan sebagai fasa diam dan diisikan ke dalam kolom. Campuran senyawa yang mudah menguap dicampur dengan gas pembawa disuntikkan ke dalam kolom, dan setiap senyawa akan dipartisi antara fasa gas (mobil) dan fasa cair (diam) mengikuti hukum partisi. Senyawa yang kurang larut dalam fasa diam akan keluar lebih dahulu.Metoda ini khususnya sangat baik untuk analisis senyawa organik yang mudah menguap seperti hidrokarbon dan ester. Analisis minyak mentah dan minyak atsiri dalam buah telah dengan sukses dilakukan dengan teknik ini.Efisiensi pemisahan ditentukan dengan besarnya interaksi antara sampel dan cairannya. Disarankan untuk mencoba fasa cair standar yang diketahui efektif untuk berbagai senyawa. Berdasarkan hasil ini, cairan yang lebih khusus kemudian dapat dipilih. Metoda deteksinya, akan mempengaruhi kesensitifan teknik ini. Metoda yang dipilih akan bergantung apakah tujuannya analisik atau preparatif. (James.2003)

C. Metode Praktikum

1.1  Alat

1.Bejana/toples yang ditutup aluminium foil 1 buah

2.Kertas Whatman/menggunakan kertas saring Whatman

3.Tempat pelarut

4.Batang lidi ukuran 15 cm sebagai penggantung kertas

5.Blower untuk pengeringan kertas

6.Sinar UV untuk melihat warna sampel yang kurang jelas

1.2  Bahan :                              Pelarut :

1.Safranin                                      Heksan:metanol:ethil asetat =1:1:1

2.Sirup

3.Methylen blue

4.Minyak

1.3 Prosedur kerja

1.Potong kertas Whatman sesuai kebutuhan dan ukuran bejana yang ada

2.Garis tipis dengan pensil dengan jarak 2 cm dari sisi bawah kertas

3.Beri tanda titik tempat sampel akan diletakkan dengan jarak 1,5-2 cm jarak tiap sampel

4.Letakkan sampel pada tiap titik sebanyak 10 ul memakai pipet kapiler

5.Sampel dikeringkan dengan blower

6.Masukkan pelarut dengan ketinggian 1-1,5 cm ke dalam bejana

7.Masukkan kertas Whatman yang telah ditetesi sampel

8.Lakukan pengembangan selama 10-15 menit/sampai pelarut hampir mencapai  batas ke-tinggian 2 cm dari batas atas/dengan ketinggia secukupnya sesuai keperluan,jika pelarut sampai  tengah kertas saring telah menunjukkan pemisahan sudah bisa dihentikan

9.Berilah tanda batas pelarut bagian atas

10.Tentukan nilai Rf dengan rumus (Rf)

11.Lakukan pengamatan,tulis hasil dan pembahasan terhadap senyawa dan komponen pada Kromatogram

D.Hasil dan pembahasan

Kromatografi adalah alat/metode untuk memisahkan senyawa berdasarkan 2 fase yaitu fase diam dan fase gerak.Fase diam adalah kertas Whatman dan fase geraknya adalah pelarut.Dalam kromatografi ada 2 prinsip dasar yaitu absorbsi dan partisi.Absorbsi adalah penyerapan dan pengikatan zat warna,sedangkan partisi adalah pemisahan zat warna.Ada 2 fase dalam penggunaan kromatografi yaitu fase gerak dan fase cair.Hal ini jika dibandingkan dengan dengan literatur adalah sama.Dalam literatur tertulis :

“ Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan molekul berdasarkan perbedaan pola pergerakan antara fase gerak dan fase diam untuk memisahkan komponen (berupa molekul) yang berada pada larutan.Molekul yang terlarut dalam fase gerak, akan melewati kolom yang merupakan fase diam.Molekul yang memiliki ikatan yang kuat dengan kolom akan cenderung bergerak lebih lambat dibanding molekul yang berikatan lemah.Dengan ini, berbagai macam tipe molekul dapat dipisahkan berdasarkan pergerakan pada kolom.Setelah komponen terelusi dari kolom, komponen tersebut dapat dianalisa dengan menggunakan detektor atau dapat dikumpulkan untuk analisa lebih lanjut.Beberapa alat-alat analitik dapat digabungkan dengan metode pemisahan untuk analisis secara on-line (on-line analysis) seperti: penggabungan kromatografi gas (gas chromatography) dan kromatografi cair (liquid chromatography) dengan mass spectrometry (GC-MS dan LC-MS), Fourier-transform infrared spectroscopy (GC-FTIR), dan diode-array UV-VIS (HPLC-UV-VIS). (Tissue BM. 2000)  “

Dalam pembuatan pelarut digunakan 3 macam bahan yaitu heksan,metanol,dan ethil asetat dengan perbandingan masing-masing 1:1:1.Heksan bersifat non polar,metanol bersifat polar,dan ethil asetat bersifat semi polar.Bahan yang digunakan adalah minyak,safranin,methylen blue,dan sirup.

Semakin jauh jarak yang ditempuh komponen/sampel maka sifat sampel tersebut semakin non polar sedangkan yang menempuh jarak terpendek maka sampel tersebut semakin bersifat polar.Dengan kata lain semakkin besar nilai Rf maka semakin non polar.Alat dan bahan yang digunakan adalah :

Alat : 1.Bejana/toples yang ditutup aluminium foil 1 buah

2.Kertas Whatman/menggunakan kertas saring Whatman

3.Tempat pelarut

4.Batang lidi ukuran 15 cm sebagai penggantung kertas

5.Blower untuk pengeringan kertas

6.Sinar UV untuk melihat warna sampel yang kurang jelas

Bahan :

1.Safranin

2.Sirup

3.Methylen blue

4.Minyak

Pelarut :

Heksan:metanol:ethil asetat =1:1:1

Prosedur kerja :

1.Potong kertas Whatman sesuai kebutuhan dan ukuran bejana yang ada

2.Garis tipis dengan pensil dengan jarak 2 cm dari sisi bawah kertas

3.Beri tanda titik tempat sampel akan diletakkan dengan jarak 1,5-2 cm jarak tiap sampel

4.Letakkan sampel pada tiap titik sebanyak 10 ul memakai pipet kapiler

5.Sampel dikeringkan dengan blower

6.Masukkan pelarut dengan ketinggian 1-1,5 cm ke dalam bejana

7.Masukkan kertas Whatman yang telah ditetesi sampel

8.Lakukan pengembangan selama 10-15 menit/sampai pelarut hampir mencapai  batas ketinggian 2 cm dari batas atas/dengan ketinggia secukupnya sesuai keperluan,jika pelarut sampai  tengah kertas saring telah menunjukkan pemisahan sudah bisa dihentikan

9.Berilah tanda batas pelarut bagian atas

10.Tentukan nilai Rf dengan rumus (Rf)

11.Lakukan pengamatan,tulis hasil dan pembahasan terhadap senyawa dan komponen pada Kromatogram

E. Kesimpulan dan saran

1.Kromatografi adalah alat/metode untuk memisahkan sampel berdasarkan 2 fase,yaitu fase gerak (pelarut) dan fase diam (kertas whatman)

2.Kromatografi ada 2 prinsip yaitu absorbsi (penyerapan dan pengikatan zat warna) dan partisi (pengikatan zat warna)

3.Semakin tinggi nilai Rf maka semakin non polar sampel yang diuji dan sebaliknya,semakin rendah nilai Rf maka semakin polar sampel yang diuji Dalam melakukan analisis pemisahan suatu senyawa dengan menggunakan kromatografi sebaiknya dilakukan dengan sangat teliti terutama dalam mengukur tinggi/jarak yang ditempuh sampel maupun pelarutnya,jika panjang warnanya kurang jelas bisa dilihat menggunakan sinar UV agar hasilnya lebih akurat.

HPLC

Kromatografi cair berperforma tinggi (high performance liquid chromatography, HPLC) merupakan salah satu teknik kromatografi untuk zatcair yang biasanya disertai dengan tekanan tinggi. HPLC digunakan untuk memisahkan molekul berdasarkan perbedaan afinitasnya terhadap zat padat tertentu. Cairan yang akan dipisahkan merupakan fasa cair dan zat padatnya merupakan fasa diam (stasioner). Teknik ini sangat berguna untuk memisahkan beberapa senyawa sekaligus karena setiap senyawa mempunyai afinitas selektif antara fasa diam tertentu dan fasa gerak tertentu. Dengan bantuan detector serta integrator kita akan mendapatkan kromatogram. Kromatogram memuat waktu tambat serta tinggi puncak suatu senyawa.

 

1.      JENIS- JENIS HPLC

Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal (jika fase diamnya lebih polar dibanding dengan fase geraknya) atau fase terbalik (jika fase diamnya kurang non polar dibanding dengan fase geraknya). Berdasarkan pada kedua pemisahan ini, sering kali HPLC dikelompokkan menjadi HPLC fase normal dan HPLC fase terbalik.
Selain klasifikasi di atas, HPLC juga dapat dikelompokkan berdasarkan pada sifat fase diam dan atau berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut, dengan jenis-jenis HPLC sebagai berikut:

1. Kromatografi Adsorbsi
Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis. Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya menggunakan fase normal dengan menggunakan fase diam silika gel dan alumina, meskipun demikian sekitar 90% kromatografi ini memakai silika sebagai fase diamnya. Pada silika dan alumina terdapat gugus hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut. Gugus silanol pada silika mempunyai reaktifitas yang berbeda, karenanya solut dapat terikat secara kuat sehingga dapat menyebabkan puncak yang berekor.

2. Kromatografi fase terikat
Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi secara kimiawi atau fase terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah hidrokarbon-hidrokarbon non-polar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan fenil. Fase diam yang paling populer digunakan adalah oktadesilsilan (ODS atau C18) dan kebanyakan pemisahannya adalah fase terbalik.
Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau dengan larutan bufer. Untuk solut yang bersifat asam lemah atau basa lemah, peranan pH sangat krusial karena kalau pH fase gerak tidak diatur maka solut akan mengalami ionisasi atau protonasi. Terbentuknya spesies yang terionisasi ini menyebabkan ikatannya dengan fase diam menjadi lebih lemah dibanding jika solut dalam bentuk spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies yang mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat.

3. Kromatografi penukar ion
KCKT penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau anion dengan suatu fase gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar di pasaran, meskipun demikian yang paling luas penggunaannya adalah polistiren resin.
Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan media air karena sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut campuran misalnya air-alkohol dan juga pelarut organik. Kromatografi penukar ion dengan fase gerak air, retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak. Kenaikan kadar garam dalam fase gerak menurunkan retensi solut. Hal ini disebabkan oleh penurunan kemampuan ion sampel bersaing dengan ion fase gerak untuk gugus penukar ion pada resin.

4. Kromatografi Pasangan ion
Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan sampel-sampel ionik dan mengatasi masalah-masalah yang melekat pada metode penukaran ion. Sampel ionik ditutup dengan ion yang mempunyai muatan yang berlawanan.

5. Kromatografi Eksklusi Ukuran
Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat digunakan untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul > 2000 dalton.
Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus sehingga solut dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat fase diam. Molekul solut yang mempunyai BM yang jauh lebih besar, akan terelusi terlebih dahulu, kemudian molekul-molekul yang ukuran medium, dan terakhir adalah molekul yang jauh lebih kecil. Hal ini disebabkan solut dengan BM yang besar tidak melewati porus, akan tetapi lewat diantara partikel fase diam. Dengan demikian, dalam pemisahan dengan eksklusi ukuran ini tidak terjadi interaksi kimia antara solut dan fase diam seperti tipe kromatografi yang lain.

6. Kromatografi Afinitas
Dalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi yang sangat spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya dapat menyerap sampel jika ada kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu pada sampel yang sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan antibodi).
Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein (enzim) dari campuran yang sangat kompleks.

2.      Beberapa kegunaan dari HPLC :

·         HPLC dengan prinsip kromatografi banyak digunakan pada industri farmasi dan pestisida.

·         Zat- zat dengan kepolaran berbeda yaitu antara sedikit polar sampai polar dapat dipisahkan dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair.

·         Asam-asam nukleat dapat dipisahkan dengan kolom penukar ion yang dikombinasikan dengan kolom butiran berlapis zat berpori.

·         Morfin, heroin dan semacamnya telah dapat dipisahkan dengan rezin Zipax-SAX.

·         Dapat memisahkan vitamin- vitamin yang larut dalam air.

·         Digunakan untuk menentukan berat molekul polimer dan masalah-masalah biokimia.

·         Dapat digunakan untuk memurnikan dan mengidentifikasi suatu senyawa.

3.      Aplikasi dalam ilmiah

Perkembangan yang baru-baru ini HPLC telah menjadi pengembangan metode HPLC denaturing (DHPLC). This procedure can separate double-stranded DNA molecules that differ by as little as one . Prosedur ini dapat memisahkan molekul DNA untai-ganda yang berbeda sekecil satu pasangan basa .The speed of analysis (approximately 5 minutes per sample) and the size of DNA fragment that can be analyzed (up to 2.0 kilobytes) has made it a preferred method for a variety of applications in the field of molecular biology. Kecepatan analisis (sekitar 5 menit per sampel) dan ukuran fragmen DNA yang dapat dianalisis (hingga 2,0 kilobyte) telah membuatnya menjadi metode yang disukai untuk berbagai aplikasi dalam bidang biologi molekuler.Applications of DHPLC include the detection of single nucleotide (SNPs). Aplikasi DHPLC termasuk deteksi tunggal nukleotida polimorfisme (SNP). These are single base-pair variations in DNA that can give valuable information on genetic variation within a population. Ini adalah satu dasar pasangan variasi dalam DNA yang dapat memberikan informasi berharga tentang variasi genetik dalam suatu populasi,  They can also help to identify the genes that cause certain human diseases.dan  juga dapat membantu untuk mengidentifikasi gen yang menyebabkan penyakit manusia tertentu. Dan aplikasi lain dari kromatrogarafi HPLC adalah dalam dunia farmasi digunakan untuk menganalisis.

Contoh analisis menggunakan kromatrografi HPLC:

·         Analisis Diazepam dalam darah

Diazepam (Valium) merupakan Senyawa golongan psikotropika. Senyawa ini berbentuk kristal agak kekuningan yang tidak larut dalam air, rumus kimiaC₂₃H₂₇N. Diazepam termasuk obat  antiansietas, antikonvulsan, dan sedatif. Mempunyai Indikasi untuk status epileptikus, ansietas atau insomnia, konvulsi akibat keracunan, kejang demam, dan sebagai obat penenang. Prinsip cara uji diazepam ini adalah dengan mengekstraksi menggunakan pelarut atau campuran pelarut yang sesuai. Kemudian sampel yang sudah melalui proses  preparasi selanjutnya diinjeksikan ke sistem HPLC.

1.      Kelebihan dan Kekurangan Dalam Penggunaan HPLC

Dengan adanya HPLC tentunya sangat membantu dalam proses kromatografi. Berikut merupakan kelebihan dari alat HPLC antara lain:

·         Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran dengan daya memisah yang tinggi.

·         Dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan analisis.

·         Dapat digunakan bermacan-macam detektor dengan kepekaan yang tinggi.

·         Kolom dapat digunakan kembali.

·         Waktu analisa cukup singkat.

·         HPLC dapat digunakan untuk isolasi zat yang tidak mudah menguap dan zat yang tidak stabil.

·         Dapat menganalisis sampel yang kecil kuantitasnya.

·         Teknik HPLC dapat dilakukan pada suhu kamar.

Kelemahan dari alat HPLC antara lain:

·         Harga sebuah alat HPLC cukup mahal.

·         Sering ada larutan standar yang tertinggal diinjektor.

·         Pada kolom dengan diameter rata-rata partikel fase diam dengan ukuran 5 dan 3 mikrometer sela-sela partikel lebih mudah tertutup oleh kotoran, jadi harus seringkali dicuci dan kemurnian larutan harus dijaga.

2.      Prinsip kerja

Pada dasarnya prinsip kerja HPLC sama dengan kromatografi lapis tipis dan kromatografi kolom, yang membedakan adalah fasa diam yang digunakan pada HPLC memiliki ukuran yang lebih kecil sehingga luas permukaan besar sehingga keseimbangan antar fasa menjadi lebih baik dan efisien.

Pada HPLC tekanan yang tinggi menyebabkan fasa gerak dapat bergerak lebih cepat sehingga difusi menjadi sekecil-kecilnya. Ukuran butir kecil pada fasa diam dan tekanan yang tinggi pada fasa gerak pada kromatografi kolom cair secara teori akan menghasilkan pemisahan yang sebaik-baiknya.

 

Injeksi sampel
Injeksi sample seluruhnya dilakukan secara otomatis sehingga tidak bisa mengetahui yang terjadi pada keadaan tingkat dasar. Karena proses ini meliputi tekanan, tidak sama halnya dengan kromatografi gas.

Waktu retensi
Waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju detektor disebut sebagai waktu retensi.Waktu retensi diukur berdasarkan waktu dimana sampel diinjeksikan sampai sampel menunjukkan ketinggian puncak yang maksimum dari senyawa itu.
Senyawa-senyawa yang berbeda memiliki waktu retensi yang berbeda pula. Untuk beberapa senyawa, waktu retensi akan sangat bervariasi dan bergantung pada:

·         tekanan yang digunakan (karena itu akan berpengaruh pada laju alir dari pelarut)

·         kondisi dari fase diam (tidak hanya terbuat dari material apa, tetapi juga pada ukuran partikel)

·         komposisi yang tepat dari pelarut

·         temperatur pada kolom

Detektor
Ada beberapa cara untuk mendeteksi substansi yang telah melewati kolom. Metode umum yang mudah dipakai untuk menjelaskan yaitu penggunaan serapan ultra-violet.Banyak senyawa-senyawa organik menyerap sinar UV dari beberapa panjang gelombang

Jumlah cahaya yang diserap akan bergantung pada jumlah senyawa tertentu yang melewati melalui berkas pada waktu itu

Interpretasi output dari detektor

Output akan direkam sebagai rangkaian puncak-puncak, dimana masing-masing puncak mewakili satu senyawa dalam campuran yang melalui detektor dan menerap sinar UV. Sepanjang anda mengontrol kondisi kolom,dapat menggunakan waktu retensi untuk membantu mengidentifikasi senyawa yang diperoleh.

Area yang berada dibawah puncak sebanding dengan jumlah X yang melalui detektor, dan area ini dapat dihitung secara otomatis melalui layar komputer.Area dihitung sebagai bagian yang berwarna hijau dalam gambar (sangat sederhana).


 

1.      Perawatan HPLC

Efisiensi pemisahan kolom HPLC tidak hanya tergantung pada kualitas kolom, namun juga pada bagaimana kolom digunakan secara umum,  kolom yang sering digunakan adalah Silika. Kestabilan mekanik yang besar, sangat baik sifat permukaan fisikokimia, berbagai ikatan kimia, dan kompatibel dengan berbagai pelarut organik.

Berikut beberapa cara perawatan HPLC agar tetap dapat digunakan secara efisien.

·         Stabilitas pH

kolom HPLC yang stabil dalam rentang pH 2 sampai 8. Jika mengukur nilai pH, pengukuran harus dilakukan dalam media air sebelum mencampur eluen dengan pelarut organik. HPLC kolom dapat digunakan di luar rentang pH. Ikatan kimia baru yang memungkinkan penggunaan sampai pH 1 untuk beberapa fasa diam. Fase stasioner didasarkan pada silika gel ultra murni juga dapat digunakan pada rentang pH yang lebih tinggi, sampai untuk pH 11, tergantung pada sifat kimia pengubah yang digunakan dalam fase gerak. Basis Besar (seperti Pyrolidine) tidak mampu menyerang permukaan silika dan oleh karena itu dapat digunakan pada pH lebih tinggi.

·         Teknik Stabilitas

Fase stasioner didasarkan pada silika secara mekanik sangat stabil, dikemas dalam kolom yang menunjukkan tidak ada batas tekanan, dan dapat digunakan di lebih dari 40 MPa (6000 psi) tanpa masalah. Tekanan menyebabkan guncangan penyaluran dalam kolom, yang menghasilkan puncak membelah pada kromatogram

·           Eluen

Penggunaan pelarut murni non HPLC menyebabkan adsorpsi ireversibel dari kotoran pada kolom. Kotoran ini memblokir situs adsorpsi, mengubah selektivitas kolom dan mengarah ke puncak memisahkan di kromatogram tersebut.

·           Penyimpanan Kolom

v  Untuk penyimpanan jangka pendek, kolom dapat disimpan dalam eluen yang digunakan dalam terakhir analisis.

v  Untuk penyimpanan jangka menengah, yaitu 2 hari atau selama akhir pekan, kolom harus dibilas dengan air yang murni untuk mencegah pertumbuhan mikroba.

v  Untuk penyimpanan jangka panjang, silika kolom tersebut harus dapat disimpan dalam pelarut aprotik. Kandungan air tidak boleh lebih tinggi dari 50%. Yang terbaik adalah pelarut Asetonitril.

Skema kerja HPLC

Pada prinsipnya kerja HPLC adalah sama yaitu pemisahan analit-analit berdasarkan kepolarannya, alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan larutan tertentu sebagai fasa geraknya. Yang paling membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak. Campuran analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya dan kecepatannya untuk sampai kedektetor (waktu retensinya) akan berbeda, hal ini akan teramati pada spectrum yang puncak-puncaknya terpisah. Ukuran skala polaritas : golongan fluorocarbon < golongan hidrokarbon < senyawa terhalogenasi < golongan eter < golongan ester < golongan keton < golongan alcohol < golongan asam.
 

1.      Pompa

Pompa pendeteksian tetap dapat dibedakan menjadi pompa torak dan pompa semprit. Pompa torak menghasilakan aliran yang berdenyut jadi memerlukan peredam denyut atau peredam elektronik untuk menghasilkan garis alas detector yang stabil jika detector peka terhadap aliran. Pompa semprit menghasilkan aliran yang tak terbatas.

2.      Injector

Cuplikan harus dimasukan kedalam pangkal kolom (kepala kolom), diusahakan agar sedikit mungkin terjadi gangguan pada kemasan kolom. Ada dua ragam utama aliran henti dan pelarut mengalir. Ada 3 macam system injector, yaitu:

a.       Stop flow : aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir, system tertutup dan aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan karena difusi di dalam cairan kecil dan resolusi tidak dipengaruhi.

b.      Septum : septum yang digunakan pada KCKT sama dengan yang digunakan pada kromatografi gas. Injector ini dapat digunakan pada kinerja sampa 60 – 70 atmosfir. Tapi septum ini tidak tahan dengan semua pelarut-pelarut kromatografi cair. Partikel kecil dari septum yang terkoyak (akibat jarum injector) dapat menyebabkan penyumbatan.

c.       Loop vaive : tipe injector ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume lebih besar dari 10µ dan dilakukan dengan cara automatis (dengan menggunakan adaptor yang sesuai, volume yang lebih kecil dapat diinjeksikan secara manual). Pada posisi load, sampel diisikan ke dalam loop pada kinerja atmosfir, bila valve difungsikan, maka sampel akan masuk dalam kolom.

3.      Kolom

Kolom merupakan jantung kromatograf. Keberhasilan atau kegagalan analisis bergantung pada pilihan kolom dan kondisi kerja yang tepat. Kolom dapat dibagi menjadi kolom analitik dan kolom preparative.

4.      Detector

Detector diperlukan untuk mengindera adanya komponen cuplikan di dalam eluen kolom dan mengatur jumlahnya. Detector yang baik sangat peka, tidak banyak berderau, rentang tanggapan liniernya lebar dan menggapai semua jenis senyawa.

Jenis-jenis detector :

·         UV/Vis

·         Retraktif indeks (RI) detector

·         Konduktifitas decetor

·         Elektroimia detector

·         PDA

·         ELSD

·         MS dectetor

5.      Fase gerak

Fase gerak memiliki syarat-syarat :

·         Murni, tanpa cemaran

·         Tidak bereaksi dengan kemasan

·         Sesuai dengan detector

·         Dapat melarutkan cuplikan

·         Mempunyai viskositas rendah

·         Memungkinkan memperoleh dengan mudah cuplikan jika diperlukan

·         Harganya wajar